ELISPOT

1.PBS 溶解抗原为 30 μg/ml，加 100 μl/孔于 PVDF 膜铺底的 96 孔灭菌板过夜；

2. 第二天吸去包被液后，加 5％FCS 的 PRMI 1640 培养基 100 μl 封闭 1 小时，37 oC；

3. 准备脾细胞悬液（用氯化铵去除红细胞，制备成单个脾淋巴细胞悬液）；

4. 从 1 × 106/孔开始，按 1:3 的稀释度开始逐孔稀释做不同浓度梯度，并做 3 个复孔，37 oC 静置培养 5 小时；

5. PBS 洗 3～5 次，生物素化的抗鼠 IgG 二抗孵育 30 min；

6. PBS 洗 3～5 次，链亲和素标记的碱性磷酸酶孵育 30 min；

7. PBS 洗 3～5 次，用底物 BCIP/NBT 显色，显微镜下观察显色反应，显色后及时终止反应；

8. 计数每孔中的斑点数目，计算每 106 个脾细胞中抗体分泌细胞数量。

藻酸盐包裹实验

1.将藻酸钠溶于无菌生理盐水，终浓度为 1.5%；

       2. 收集培养的肿瘤细胞，用无血清的培养基洗涤 1 次，将细胞沉淀重悬于 1.5%藻酸钠溶液中；

3. 将上述肿瘤细胞悬浮液用 1 ml 加样枪缓慢滴入磁力搅拌的 250 mM CaCl2 溶液中，形成乳白色的藻酸盐小珠。继续静置于 250 mM CaCl2 中 30 min 即可使用。以上操作步骤均在无菌条件下进行；

4. 将第 4 次免疫后 7 天的小鼠用苯巴比妥钠 0.1ml (按 100 mg/kg 计) 腹腔注射麻醉，小鼠麻醉后置于解剖台上，切开背部皮肤，皮下植入 4 粒藻酸盐包裹颗粒，缝合皮肤，外敷手术胶膜；

5. 天以后，小鼠经尾静脉注入100 μl (按 100 mg/kg计) FITC 标记的葡聚糖(FITC-Dextran)；

6. 20 min 后处死动物，取出藻酸盐颗粒，常温下加入 1 ml 的生理盐水，剪碎研磨颗粒，再加入 1 ml 的生理盐水,混匀标本，放置 1 小 时 ，1500 rpm 离心 5 min。取上清液用荧光酶标仪测定；

7. 用不同浓度的 FITC-Dextran 制备标准曲线。